STED: a Hell of microscopy

Au XIXème siècle, Ernst Abbe avait montré que la microscopie optique traditionnelle ne pourrait jamais obtenir une résolution supérieure à la moitié de la longueur d’onde de la lumière. Cette limite physique, connue comme la limite de Abbe, signifiait que la résolution  n’irait jamais au-delà de 0,2 micromètres ou 200 nm (figure 1).

Figure 1 : représentation originale de la limite de Abbe (credit: Johan Jarnestad /The Royal Swedish Academy of Sciences)

En effet, une lentille peut au maximum concentrer la lumière sur un spot de cette dimension, mais il est physiquement impossible de la diminuer.

L’expression précise pour la résolution limite est donnée par :

λ étant la longueur d’onde de la lumière incidente et le produit 2nsinα est l’ouverture numérique, où n est l’indice de réfraction de la lentille et α l’angle définit selon la figure 2.

Figure 2 : la lumière est ici concentrée au maximum, créant ainsi le petit spot vert que l’on retrouvera ultérieurement dans la figure 3 (capture d’écran d’une lecture faite par Stefan Hell, dont voici le lien http://www.ibiology.org/?s=STED)

Cependant grâce au lauréats du prix Nobel de chimie 2014 (deux citoyens américains, Eric Betzig de l’Institut médical Howard Hughes et William Moerner de l’Université de Stanford, et le citoyen allemand Stefan Hell de l’Institut Max Planck) cette limite a été dépassée,  projetant ainsi la microscopie optique traditionnelle dans le nanomonde et certainement au-delà…

L’idée proposée dans la microscopie STED est d’inhiber sélectivement la fluorescence de marqueurs biologiques fluorescents dans les parties extérieures du spot. La figure 3, ci-dessous, présente le spot vert, introduit dans la figure 2, dont la dimension correspond à la limite de Abbe. Ainsi l’ensemble des marqueurs, présents dans ce spot, émet de la fluorescence suite à une excitation lumineuse ce qui engendre un excès de lumière provenant de tous les points du spot et donc une définition faible.

Figure 3 : spot dont la dimension correspond à la limite de Abbé (capture d’écran de la lecture de Stefan Hell)

La figure 4 illustre la technique STED, où le but est d’illuminer le spot avec un faisceau d’excitation et un faisceau STED ayant la forme d’un « Donut ». Le rôle de ce dernier est d’empêcher la fluorescence en périphérie. En effet lorsqu’un matériau fluorescent (marqueurs biologiques) excité est illuminé à nouveau, cela provoque un retour à son état fondamental avec l’émission d’un photon identique au photon d’illumination. Au centre, là où le faisceau d’excitation a son intensité maximale, l’intensité du faisceau STED est minimum et n’y influence pas les marqueurs qui restent lumineux. Par contre, il éteint les marqueurs périphériques par émission stimulée.

Figure 4 : technique STED (capture d’écran de la lecture de Stefan Hell)

Il suffit alors de pratiquer ce procédé sur différents points de l’objet que l’on veut observer et d’enregistrer à chaque fois une image et finalement de les mettre ensemble. Un peu comme si on allumait une à une les lampes d’une guirlande, que l’on prenne une image à chaque fois et que l’on fasse une seule image de toutes les prises qui révèlerait l’ensemble de la guirlande.

La figure 5, ci-dessous, permet de comparer deux images, une obtenue avec une microscopie confocale et l’autre avec une microscopie STED.

Figure 5 : image de gauche → micrscopie confocal et image de droite → microscopie STED. L’objet d’observation est une protéine, la vimentine, qui aurait un rôle d’ancrage de position  pour divers organites cellulaires dans le cytoplasme. Images courtesy of Leica Microsystems, Germany

« …Moreover, we will learn how cells interact with each other in tissues, especially in the brain, helping us to understand how memory and thought work on molecular level. This all will profoundly change what we know and may be able to do in the future. »Interview du Prof. Dr. Stefan W. Hell, voir références.

« It’s just changed so much in science, it opened up so many new fields and questions. Going down to the resolution limit, where you can see proteins interacting, DNA unfolding. If you go down to that level and you can watch this in live cells, that’s such a leap forward. You almost don’t need biochemistry anymore! Biochemistry is more abstract, because you have solutions and tubes and you deduce what is happening from that. » Dr Stefanie Reichelt, head of imaging and microscopy at the Cancer Research UK Cambridge Institute.

« It’s incredible what you can do now. On my timescale, if you had suggested being able to look at something on a one nanometer scale—an atomic scale—50 years ago, you’d have been laughed out of the room. » Professor Thomas Barton, president of the American Chemical Society.

Références

Abbott, A. (2009). Microscopic marvels: The glorious resolution. Nature News, 459(7247), 638‑639. doi: 10.1038/459638a

Van Noorden, R. (2014). Nobel for microscopy that reveals inner world of cells. Nature. doi: 10.1038/nature.2014.16097

Interview with Stefan Hell, conducted by Peter E. Andersen, Technical University of Denmark on occasion of Laser World of Photonics 2013 in Munich. http://www3.mpibpc.mpg.de/groups/hell/publications/pdf/Stefan_Hell_ECBO.pdf

Seminal papers by the Laureates, further work by the Laureates related to SRFM and STED techniques and additional articles related to SRFM and STED techniques in AIP Publishing journals (free access through 12/31/14). http://www.aip.org/science-news/nobel/chemistry2014/articles

IBiology, Bringing the World’s Best Biology to You. http://www.ibiology.org/?s=STED

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